显微技术－电镜样品制备【微生物学研究发展】 动物世界
用电子显微镜观察的样品也要经过认真细致的处理，以至于今天出现了一门非常有用的技术科学—电子显微镜学。电子显微镜观察样品的方法很多，基本上可以分为透射型和扫描型两类。前者是电子流通过观察样品而形成图象；后者则是用来观察微生物的表面细节，分辨率大约在7纳米左右。待观察的样品则必须进行相当复杂的处理，而且有些处理方法是和用光学显微镜观察时很不相同的，因为在进行电子显微镜观察时受到一些特殊限制。首先，由于样品处于高真空环境中，样品必须尽可能保持原状，所以微生物样品要进行固定和脱水处理；第二，要使电子束全部透过样品，所以样品必须尽可能薄；第三，为了便于观察，图象的反差要大，光学显微镜是靠光的吸收差异来达到，而电子显微镜则靠电子散射程度，决定电子散射程度的是元素的质量和厚度，为此常用重金属处理，例如金、铂等处理。投射电子显微镜的观察样品的主要制备方法是：
1、投影法。在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影我们可以了解样品的立体形状、高度，通常用这种方法来观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒。
2、负染法。因为这种方法是将样品的背景染色以突显样品，所以称为负染。一般是用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，例如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会投入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反应样品的内部结构。用这种方法可以观察细菌细胞、病毒等。
3、超薄切片法。这是最常用的方法，因为可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。通常是要按照一定程序对样品进行固定，脱水，然后包埋在树脂中作为支持物，用超薄切片机切成极薄的切片。因为只有在20—100纳米厚度的切片用投射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。
4、冰冻蚀刻法。所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。
和投射电子显微镜是靠透过物体的电子成像不同，扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射的电子。扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描。电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。
