生物化学与分子生物学实验教程
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作者： 倪菊华 主编
出 版 社： 北京大学医学出版社
出版时间： 2008-5-1字数：版次： 1页数： 122印刷时间：开本： 16开印次：纸张：I S B N ： 9787811165579包装： 平装内容简介
本书是在编者多年使用的本科生及研究生生物化学与分子生物学实验讲义的基础上，经修订和改编而成。根据学科发展，在原有实验讲义的基础上，删去了部分验证性实验，增加了一些反映最新进展的实验技术。全书包括总则、基本实验和高级实验三部分。总则介绍生物化学与分子生物学实验操作基本要求以及常用仪器的使用与维护。基本实验包括蛋白质分离与纯化、酶学实验和核酸提取与分析。除了常规经典的生化分析技术，新增了SDS-PAGE、等电聚焦电泳、DNA重组与鉴定、PCR等分子生物学热门技术，可作为本科生的普通生物化学与分子生物学实验教材。高级实验收集了RT-PCR、GST、pulldown、Northern Blot等分子生物学最新研究技术，有一定难度，可作为生物化学与分子生物学专业研究生的实验教材。
目录
总则
实验室规则
基本操作
常用仪器简介
基本实验
蛋白质分离与纯化
实验一 血清的盐析及含量测定
实验二 凝胶过滤层析
实验三 醋酸纤维素膜电泳
实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
实验五 等电聚焦电泳
酶学实验
实验一 底物浓度对酶促反应速度的影响
实验二 酶浓度对酶促反应速度的影响
实验三 pH对酶促反应速度的影响
实验四 温度对酶促反应速度的影响
实验五 抑制剂对酶促反应速度的影响
实验六 乳酸脱氢酶粗提液的制备及活力测定
核酸提取与分析
实验一 质粒DNA的微量快速提取
实验二 质粒DNA的酶切与鉴定
实验三 DNA重组与鉴定
实验四 聚合酶链反应技术（PCR）
高级实验
实验一 生肌蛋白的诱导表达和提取
实验二 蛋白质免疫印迹分析（Western Blot）
实验三 免疫共沉淀
实验四 GST pull-down分析
实验五 肝细胞总RNA提取及鉴定
实验六 RT-PCR技术
实验七 探针标记
实验八 Southern Blot
实验九 Northern Blot
实验十 电泳迁移率变动分析（EMSA）
附录 化学试剂的规格与保管
主要参考文献
书摘插图
基本实验
蛋白质分离与纯化
蛋白质是一切活细胞和有机体的重要组成成分。细胞和体液中蛋白质都是成千上万种相混合而存在，要分析单个蛋白质的结构和功能需先分离纯化蛋白质。通常利用蛋白质的两性解离、等电点、紫外吸收等理化性质，采取盐析、电泳、层析等方法对蛋白质进行分离、纯化。蛋白质分离、纯化过程一般可分为以下几个步骤：
（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来，并保持其天然状态及活性。因此要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：①机械破碎法，可使用高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等设备；②渗透破碎法，即在低渗条件使细胞溶胀而破碎；③反复冻融法，生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破；④超声波法，使用超声波振荡器使细胞破碎；⑤酶法，用溶菌酶破坏微生物细胞等。
（二）蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液将蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提需加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、TritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意在低温下操作，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将目的蛋白与其他杂蛋白分离。比较简便、有效的方法是根据蛋白质溶解度的差异进行分离。常用的有下列几种方法：①等电点沉淀法，不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离；②盐析法，根据不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出，盐析沉淀的蛋白质不变性；③有机溶剂沉淀法，中性有机溶剂如乙醇、丙酮可沉淀蛋白质，其沉淀机制是降低水的介电常数，导致具有表面水层的蛋白质分子脱水，相互聚集而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，并选择合适的有机溶剂浓度。
（四）样品的进一步分离、纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
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