龟病的诊断
龟病防治，与其他水产动物疾病防治一样，贯彻以防为主，防治结合，正确诊断，对症治疗的方针。饲料、环境、病原、龟体相互作用引起龟病，在防治龟病时，重要的理念是"平衡"，通过营养、环境、免疫、生态、药物等各种调控途径，调节龟体内外平衡，实现健康养龟。龟病的诊断是对症治疗前的必要手段。
目前龟病诊断采用常规方法，主要通过现场调查、目检、镜检和血清学鉴定等方法来进行。血清学诊断与治疗技术已在水产养殖中应用(Rabb等，1964；杨先乐等，1995；虞蕴如等，1996；刘金兰等，1999)。
一、现场调查通过现场调查摸清发病规律、流行情况、危害程度、传染性还是侵袭性，是体表还是内脏病变，摄食是否正常，活动是否异常，水源水质(环境质量)、饵料质量等。 (一)水源：要求符合国家渔业水质标准，最好选用无污染的河水、池塘水、井水及pH正常、微量元素不超标的深井水。如氟的含量超标，对龟有致畸的可能。 (二)水质：龟一旦发病后，如果怀疑是水质问题，就要对水质进行分析测定，常规测定的项目有水色、透明度、溶氧量、pH值、COD、氨态氮、亚硝酸态氮、硝酸态氮、磷酸根离子、二氧化硅、钾、钠、钙、镁、碳酸根离子、碳酸氢根离子、硫化氢、氯离子等18项，快速比色测定方法一般准确度不高，但可以大致了解水质，方法简便，有条件时提倡用传统的水化学分析方法或使用进口的高精度仪器测定，准确率高。具体测定可根据病情分析选择项目，不一定每个项目都要去做。"肥活嫩爽"不仅是养鱼水质的要求，也是养龟所需要的最佳水环境。适度的绿色肥水，还可抑制真菌病的发生。 (三)饵料：龟的许多疾病是由饵料造成的。变质的动物饵料，常常添加在配合饲料中饲喂，可是2个月后，龟就会因脂肪代谢不良症大量发病死亡，且没有特效方法。饵料中长期缺少维生素，也会引起许多疾病，在疑难龟病防治中，采用常规的抗病毒、杀菌药物不能奏效时，添加维生素效果特别明显，表明维生素的缺乏引起龟的免疫抵抗力下降。同样矿物质缺少亦易导致龟病的发生。因缺少某些维生素引起的疾病，采用改变饲料结构或在原饲料中补充大剂量(治疗量)的水溶性维生素，并改善水环境，能在短期内治愈，效果特别显著。 (四)判断：龟生病后，从摄食状况可以看出，水温正常情况下，但龟的食量突然减少，龟在食台上静卧不动，不怕人，不肯下水，呆滞，拒食，或浮于水面，都是有病的表现。对于条件好的大型工厂化养龟场，可在食台上方安置摄像机，对龟的活动和摄食情况进行拍摄，然后将拍到的录像资料进行分析。也可在养龟温室内设置多个摄像头，通过与电脑连接，进行多池切换电脑监控，这样可对龟病早发现，及时采取预防和治疗措施。 (五)建立档案。内容包括：龟苗的采购或繁殖情况，下池时间、龟池龟体消毒方法、放养密度、控温情况、水质变化、饵料种类、投喂量和摄食情况、用药品种剂量方法，历年疫情，活动、死亡情况等。以便作为疾病诊断的参考依据。
二、目检主要观察龟体表、眼睛、口腔、泄殖腔等部位，内脏病变通过解剖，观察部位有肝、脾、肾、肺、肠、生殖腺体、系膜等。目检比较容易观察到白眼病、红脖子病、烂颈病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、水霉病、水蛭病、钟形虫病等龟病，对内脏病变可进一步用镜检、血清学诊断方法确诊。
三、镜检用普通显微镜和电子显微镜进行病原体检查和鉴定
四、血清学鉴定这是一种简易快速的凝集试验，在载玻片上的生理盐水中，滴加抗血清和抗原各1滴，混合鉴别阳性或阴性(Bullock，1971)。常用于细菌性疾病，对致病菌的快速诊断。血清学鉴定简单地说就是利用抗原与抗体反应的特异性和敏感性来对龟病的病原作出准确的判断，这种方法方便、快速、灵敏、准确，当制成相应的试剂盒后很容易推广，但它的应用需要较坚实的研究基础，尤其要对病原的分离、提纯，抗体的制备，以及血清学反应的条件等有丰富的资料。血清凝集试验有玻片凝集试验，玻板凝集试验，试管凝集试验和微量凝集试验四种，前两种是定性试验，用于未知细菌的鉴定，后两种是定量试验，用于测定被检血清中有无某种抗体及其滴度，以辅助临床诊断或流行病学调查。玻片凝集试验所需仪器少，简单易行，是目前常用来鉴定龟细菌性病原的方法。 1. 试剂 生理盐水，水产用生理盐水 NaC1含量一般为0.7%，亦可用人、兽用生理盐水替代；诊断血清，将相应的病原菌纯化后免疫兔(或用羊，成本低，取得高免血清多)，取其血清而获得。血清置于-30℃左右保存，使用前45℃灭活 l小时。 2. 器材 载玻片、接种环、酒精灯。 3. 方法 待检菌为纯培养物，取洁净载玻片 l块，一端滴生理盐水 l滴，另一端滴加诊断血清 l滴。用接种环沾取待检菌的纯培养物少许，分别和生理盐水、诊断血清混匀，将载玻片轻轻反复摆动，注意勿使试验区和对照区相互混合。静置数分钟后观察结果。待检菌为病龟的内脏器官或病灶部位，取一小块内脏或病灶组织分别在载玻片的两端涂抹，然后一端滴加生理盐水一滴，另一端滴加诊断血清一滴。按上法所述轻轻地振动载玻片。数分种后观察结果。 4. 判断 载坡片上如若出现乳白色凝集块者即为阳性反应(即有该病原菌)，如为均匀的乳白色而无凝集块者为阴性反应(即无此病原菌)，生理盐水对照滴则为均匀的乳白色。
五、病原分离为了对龟病作出确诊，尤其是细菌性和病毒性龟病，可进行病原分离。通过病原分离，病原的纯培养，可获得大量的病原体，然后根据病原体的形态特征，生化特征以及血清学特征，对龟病作出准确的判断。 1. 病毒分离 以无菌的方法取濒死或刚死龟的肝、脾、肺、肾等内脏组织，用每毫升含800~1000国际单位(或毫克)双抗的 Hanks液洗3次，然后研磨匀浆成1：10悬液，冻融3次，离心取上清液，使其通过细菌滤器，将滤液接种于敏感细胞，观察能否使其致细胞病变；或者滤液经超速差异离心或密度梯度离心后，在电镜下进行观察。 2. 细菌分离 将濒死或刚死的病龟的病灶部位用无菌的生理盐水冲洗3次后，取深层的组织接种于适宜的培养基上；或将病龟用无菌生理盐水冲洗之后，以无菌的手段打开背腹甲，取腹水或肝、脾、肾等内脏组织接种于适宜培养基，经28℃~30℃培养24~48小时后，进行分纯。然后观察菌落的形态，菌体的特征，并利用糖类代谢，氨基酸和蛋白质代谢，有机酸和铵盐，呼吸酶类，毒性酶类，抑菌，美蓝还原，中性红，胆汁(胆盐)溶菌，嗜盐性等生理生化试验对其进行鉴别，或者用血清学试验进行鉴定。 3. Hanks液的配制：① NaCl 8克、KCl 0.4克、MgSO47H2O 0.1克、MgCl·6H2O 0.1克溶于800毫升重蒸馏水中；② CaCl2(无水)0.14克溶于100毫升重蒸馏水中；③ 葡萄糖1.0毫克、NaHPO4 0.154克、KH2PO4 0.06克、0.4%酚红液 5毫升溶于100毫升重蒸馏水中。将上述3种溶液混和，8磅30分钟灭活菌，或用玻璃滤器过滤。保存在5℃备用，用前以5%NaCO3调pH。
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